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本试剂盒是一种先以萤光素(luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)，后以肠腔素(coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶(Renilla luciferase)，并且在后续加入海肾萤光素酶底物时，同时加入抑制萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的物质，使后续检测仅仅检测到海肾萤光素酶的活性，实现双萤光素酶报告基因检测。

通过萤光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在luciferase的上游，或把3’-UTR区克隆在luciferase的下游等，构建成报告基因(reporter gene)质粒。然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。Renilla luciferase相对更多地被用作转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物萤光。海肾萤光素酶是一种分子量约为36kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物萤光。生物萤光可以通过化学发光仪或液闪测定仪进行测定。萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。海肾萤光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nm。本试剂盒的检测原理参考图1。

图1．双萤光素酶的检测原理图。

组分	100次	1000次
报告基因细胞裂解液	60mL	10×60mL
萤光素酶检测试剂	10mL	10×10mL
海肾萤光素酶检测缓冲液	10mL	10×10mL
海肾萤光素酶检测底物(100X)	100μL	10×100μL

保存：报告基因细胞裂解液和海肾萤光素酶检测缓冲液在4℃保存1个月有效，-20℃保存一年有效，-80℃可以长期保存；萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测底物(100X)在-20℃避光保存6个月有效，-80℃避光保存一年有效。

• 加入海肾萤光素酶检测工作液后对于上一步骤中的萤火虫萤光素酶的抑制可以达到99%以上。但总会残留微量活性，因此，宜在转染时把海肾萤光素酶的表达量控制在其RLU读数高于萤火虫萤光素酶RLU读数的10%。海肾萤光素酶的读数高于萤火虫萤光素酶的读数是完全可以的，通常不会有明显的负面影响。
  
• 为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同的时间内，例如30秒内；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂。
  
• 由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。
  
• 为保证萤光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。经测试，反复冻融三次，对测定结果无明显影响。
  
• 样品和测定试剂混合后，必须等待1～2秒，再进行测定。测定时间通常为10秒，根据情况也可以测定更长或更短时间，但是同一批样品宜使用相同的测定时间。
  
• 海肾萤光素酶检测底物(100X)配制在无水乙醇中。由于无水乙醇容易挥发，有时会在初次使用时发现体积明显小于100μL的情况，此时用无水乙醇把体积补足至100μL，并混匀后即可使用。
  
• 海肾萤光素酶检测工作液宜配制后立即使用。如不能立即使用，-20℃可以保存一周。随着保存时间的延长检测效果会不断下降，因此不可配制成工作液后长期保存。

• 裂解细胞：将报告基因细胞裂解液充分混匀后，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。
  
  • 对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后，参考下表加入适量的报告基因细胞裂解液；对于悬浮细胞：离心去上清后，参考下表加入适量报告基因细胞裂解液。
    

    器皿类型	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板
    报告基因细胞裂解液(μL/孔)	100	150	200	300	500

    
    注：如果萤光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小为100μL。
    
  • 充分裂解后，10000～15000g离心3～5分钟，取上清用于测定。
    注：细胞裂解后可以立即测定萤光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。
  
  
• 融解萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温。海肾萤光素酶检测底物(100×)置于冰浴或冰盒上备用。
  
• 按照每个样品需100μL的量，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照1:100加入海肾萤光素酶检测底物(100×)配制成海肾萤光素酶检测工作液。例如，1mL海肾萤光素酶检测缓冲液中加入10μL海肾萤光素酶检测底物(100×)充分混匀后即可配制成约1mL海肾萤光素酶检测工作液。
  
• 按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。
  
• 每个样品测定时，取样品20～100μL(如果样品量足够，请加入100μL；如果样品量不足可以适当减少用量，但同批样品的使用量宜保持一致)。
  
• 加入100μL萤火虫萤光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。
  
• 在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入100μL海肾萤光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。本试剂盒的检测效果可以参考图2。
  
  图2.本试剂盒的检测效果。实际读数会因细胞数量、转染效果、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
  
• 在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的RLU值除以海肾萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫萤光素酶为内参，也可以进行类似计算。

• Luminometer和荧光分光光度计有何不同？
  荧光分光光度计检测的样品本身不能发光，样品需要由特定波长的激发光激发，然后才能产生荧光并被荧光分光光度计检测。Luminometer检测的样品本身可以发光，不需要激发光进行激发。也就是说luminometer是检测化学发光(萤光)的仪器。有些型号的荧光分光光度计也具有luminometer的功能，即也可以检测化学发光。您所使用的荧光分光光度计能否用于化学发光的测定请仔细阅读该仪器的说明书。
  
• 可以进行ATP化学发光检测的仪器是否就可以用于本试剂盒的检测？
  是。ATP化学发光的检测原理和本试剂盒的原理相同，可以用相同的仪器测定。

附录：不同货号的荧光素酶报告基因检测试剂盒比较和选择

产品货号	YTB2101	YTB2102	YTB2103	YTB2104	YTB2304	YTB2109	YT271	YT272	YT273
产品简称	Bright-Lurg	One-Lurg	Steady-Lurg	Seansy-Lurg	Seansy-Lurg Plus	Dual-Lurg	Fire-luc	Reni-luc	Both-luc
检测对象	萤火虫 萤光素酶	萤火虫 萤光素酶	萤火虫 萤光素酶	海肾 萤光素酶	海肾 萤光素酶	双萤光素酶	萤火虫 萤光素酶	海肾 萤光素酶	双萤光素酶
检测方法	一步法直接检测						两步法收集细胞后检测
检测灵敏度	特别灵敏	非常灵敏	较灵敏	较灵敏	非常灵敏	非常灵敏	非常灵敏	特别灵敏	特别灵敏(Firefly) 非常灵敏(Renilla)
信号强度	特别高	非常高	较高	较高	非常高	非常高	非常高	特别高	特别高(Firefly) 非常高(Renilla)
信号半衰期	0.5～1小时	1～2小时	5～6小时	1～2小时	15分钟	1～2小时	约60分钟	5～10分钟	＞1小时(Firefly)
产品稳定性	较稳定(冻融10次保留90%，室温3天保留55%)	较稳定(冻融10次保留90%，室温3天保留60%)	较稳定(冻融10次保留85%，室温3天保留50%)	非常稳定(冻融10次无影响，室温3天保留80%)	特别稳定(冻融10次或室温3天，无显著影响)	较稳定(冻融10次保留95%、90%，室温3天保留50%、95%)	较稳定	较稳定	较稳定
线性范围(细胞数)	50～10万个						-
推荐指数	★★★★★	★★★★	★★★★	★★★★★	★★★★★	★★★★★	★★★★	★★★★	★★★★

不同报告基因检测试剂盒的选择：

• 对于96孔板、384孔板中细胞内荧光素酶活性测定或高通量检测时，推荐使用Bright-Lurg (货号：YTB2101)、One-Lurg (货号：YTB2102)、Steady-Lurg (货号：YTB2103)、Seansy-Lurg (货号：YTB2104)、Seansy-Lurg Plus (货号：YTB2304)和Dual-Lurg (货号：YTB2109)这六款一步法直接检测试剂盒。与Fire-luc萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT271)、Reni-luc海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT272)和Both-Luc双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT273)这三款收集细胞后检测的两步法试剂盒相比，一步法更加简单快捷，细胞可以在同一块多孔板中培养和检测，无需洗涤细胞，无需更换或去除培养液，也无需裂解和收集细胞，只需把试剂盒中对应的荧光素酶检测试剂与培养细胞等体积混合，反应数分钟后即可进行化学发光检测。两步法检测试剂盒，需要先裂解并收集细胞或组织样品，然后再进行测定。
  
• 对于使用培养皿、6孔板等细胞样品比较多的情况下，推荐使用萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT271)、海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT272)和双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT273)这三款两步法检测试剂盒。先使用此类试剂盒配套的报告基因检测裂解液裂解并收集细胞样品，样品的用量可以根据细胞内荧光素酶的表达水平在20～100μL范围内进行适当调整，而且制备的样品如果不能立即检测，也可以先冻存待后续检测。同时，裂解的细胞样品也可以用于Western检测等。裂解后的样品也可以使用Bright-Lurg (YTB2101)、One-Lurg (货号：YTB2102)、Steady-Lurg (货号：YTB2103)、Seansy-Lurg (货号：YTB2104)、Seansy-Lurg Plus (货号：YTB2304)和Dual-Lurg (货号：YTB2109)这六款一步法直接检测试剂盒进行检测的，此时检测试剂的推荐用量为100μL，推荐的样品体积为20μL。
  
• 对于一步法萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，如果希望发光信号比较强，并在30分钟内即可进行检测，推荐使用Bright-Lurg；如果对信号稳定性要求特别高，需要批量或连续操作，推荐使用Steady-Lurg；如果对发光信号和稳定性都有要求，推荐使用信号强度和稳定性都比较折中的One-Lurg。对于常规的实验室检测，优先推荐使用Bright-Lurg。
  
• 对于一步法海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒，如果样品中荧光素酶活性比较低，希望发光信号比较强，并在10分钟内即可进行检测，推荐使用具有超高灵敏度的Seansy-Lurg Plus；如果对信号稳定性要求比较高，需要批量或连续操作，推荐使用Seansy-Lurg。

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